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无缝克隆是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术，该技术突破传统，不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制，利用同源重组的原理，可将任何DNA片段克隆至任何载体的任何位点。反应及转化时间短，阳性率达95%以上。

• 简单、高效地定向克隆DNA片段。
  
• 可同时定向克隆两个或多个DNA片段。
  
• 不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制。
  
• 省时，反应时间加转化时间短至20分钟。
  
• PCR产物（仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体）可直接进行重组反应，无需纯化。
  
• 本制品足够20次20μL体系的无缝克隆。
  
• 本制品只能用于科研。

• 线性化载体的制备：
  可通过单酶切、双酶切或PCR扩增的方法来制备。（如果线性化不彻底，将会导致阴性克隆的产生，推荐使用双酶切或PCR扩增的方法。）
  
• DNA片段的制备：
  
  1. DNA片段可通过PCR扩增或酶切的方法制备，PCR扩增片段无需纯化即可用于重组反应。
     
  2. PCR扩增法引物设计原则：引物的3‘端必须包含18～50个能与模板DNA结合的碱基序列，以便PCR扩增出目的DNA片段。引物的5‘端必须包含15～80个与线性化载体末端同源的碱基序列，以便PCR扩增片段能与线性化载体进行重组反应。
• 重组反应：
  
  3. 按照如下体系操作：
     

     成分	用量
     线性化载体	50～100ng
     自备的DNA插入片段	X ng
     2×无缝克隆Mix	10μL
     超纯水	至20μL

     
     注：目的片段与载体的摩尔比建议在2:1-3:1之间。
     
  4. 50℃反应15分钟，然后将离心管放置于冰上。如当天不进行转化实验，请将连接产物放-20℃保存。
     注：当插入片段总和>5kb的时候，可适当延长孵育时间到30～50min。
• 转化：
  
  5. 取5μL连接液至50～100μL刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴2～30分钟。
     
  6. 42℃水浴热激30秒。
     
  7. 立即放置于冰上静置2分钟。
     
  8. 加入300～500μL无菌SOC或LB培养基（不含抗生素），37℃，200～250rpm振荡培养60分钟。
     
  9. 吸取200μL菌液涂板，为得到更多克隆，可先3000g离心2分钟，弃掉部分上清，用移液器轻吹菌体，至充分悬浮，取全部菌液涂板，然后37℃培养过夜（12～16小时）。
     
  10. 用菌落PCR、直接测序或其他方法鉴定重组子。